(Notícias Nanowerk) Pesquisadores do Centro Médico Universitário de Göttingen (UMG), Alemanha, desenvolveram um novo método que torna possível, pela primeira vez, obter imagens da forma tridimensional das proteínas com um microscópio convencional. Combinada com inteligência synthetic, a microscopia de expansão em nanoescala em uma etapa (ONE) permite a detecção de alterações estruturais em proteínas danificadas ou tóxicas em amostras humanas. Doenças como a doença de Parkinson, que se baseiam no enrolamento incorreto de proteínas, poderiam assim ser detectadas e tratadas numa fase inicial.
A microscopia ONE foi nomeada uma das “sete tecnologias para observar em 2024” pela revista Nature e foi publicada recentemente na renomada revista Biotecnologia da Natureza (“A microscopia de expansão em nanoescala de uma etapa revela formas individuais de proteínas”).
A imagem de fluorescência é uma das ferramentas mais versáteis e amplamente utilizadas em biologia para observar processos biológicos em células vivas. Apesar dos avanços na tecnologia e das melhorias na resolução, a visualização de moléculas únicas e a organização de complexos moleculares utilizando microscopia de fluorescência continua a ser um desafio. Até agora, isso só period possível usando métodos caros de biologia estrutural, como microscopia eletrônica (EM) e, em explicit, crio-EM, nos quais as amostras são fotografadas com um feixe de elétrons muito forte a uma temperatura extremamente baixa.
Silvio O. Rizzoli, diretor do Departamento de Fisiologia Neuro e Sensorial do Centro Médico Universitário de Göttingen (UMG), porta-voz do Centro de Imagens Bioestruturais de Neurodegeneração (BIN) e membro do Cluster de Excelência “Bioimagem Multiescala: de máquinas moleculares a redes de células excitáveis” (MBExC), e o Dr. Ali Shaib, líder do grupo do Departamento de Fisiologia Neuro e Sensorial da UMG, desenvolveram agora um método usando alguns métodos simples, mas truques eficazes para visualizar moléculas individuais em detalhes usando microscopia óptica convencional.
Em vez de usar microscópios caros e de alta resolução para melhorar a resolução, eles desenvolveram a microscopia One-step Nanoscale Growth (ONE). Neste método, o quantity da amostra é aumentado ligando as células e as estruturas nelas contidas a um gel absorvente de água que penetra nas células. Ao absorver água, o gel aumenta até 15 vezes o seu quantity. Isso faz com que as moléculas na amostra se separem uniformemente e também se tornem maiores, de modo que possam ser visualizadas com um microscópio óptico após serem especificamente marcadas com moléculas fluorescentes.
Combinado com um método baseado em inteligência synthetic para avaliar as alterações de fluorescência, os cientistas conseguiram pela primeira vez fazer o que antes só period possível com microscopia crioeletrônica de alta resolução e tecnologia de raios X: “Agora somos capazes de reconstruir Estruturas de proteínas 3D a partir de imagens bidimensionais de fluorescência”, diz o professor Rizzoli.
Isto oferece uma oportunidade sem precedentes de visualizar diretamente detalhes estruturais finos de proteínas individuais, bem como complexos multiproteicos em células ou isoladamente. Mudanças na estrutura espacial das proteínas também podem ser facilmente detectadas com UMA microscopia.
Numa colaboração com colegas de Göttingen e Kassel, agregados de proteínas moleculares, típicos da doença de Parkinson, foram visualizados e classificados em amostras de líquido cefalorraquidiano de pacientes. Isto é promissor para melhorar a detecção precoce da doença de Parkinson, que afecta milhões de pessoas em todo o mundo.
UMA microscopia é um método simples e econômico que pode ser realizado em qualquer laboratório com um microscópio convencional e atinge um nível de resolução de cerca de um nanômetro. Isso é cerca de 100.000 vezes menor que o diâmetro de um fio de cabelo humano. Os autores fornecem o software program necessário como um pacote de código aberto gratuito.
Sobre o método de microscopia ONE
A resolução dos microscópios de luz convencionais é limitada pelas leis da óptica: objetos menores que 200 nanômetros, como anticorpos com tamanho de cerca de 15 nanômetros, aparecem borrados e não podem ser visíveis separadamente se estiverem separados por menos de 200 nanômetros. A microscopia de super-resolução contorna esse limite de difração com truques ópticos, de modo que resoluções de até dez nanômetros ou menos podem ser alcançadas. No entanto, isto requer microscópios muito caros.
UMA microscopia depende de uma ampliação do quantity da amostra para contornar esse limite de difração. As células e as estruturas que elas contêm são primeiro ligadas quimicamente a um gel absorvente de água, como o encontrado nas fraldas para bebês. Ao absorver água, o gel se expande junto com a amostra, fazendo com que as moléculas individuais se afastem umas das outras. O efeito adicional do calor ou das enzimas leva à divisão das moléculas de proteína. São formados fragmentos individuais, que são movidos uniformemente em diferentes direções durante a expansão em grande escala em até 15 vezes, enquanto seu arranjo espacial é mantido.
A marcação direcionada com moléculas fluorescentes permite então que os fragmentos individuais de proteínas, que agora estão localizados a uma distância acima do limite de difração, sejam visualizados usando um microscópio óptico convencional.
“Ficamos surpresos ao ver que podemos realmente visualizar a forma de Y dos anticorpos com microscopia de fluorescência”, diz o professor Rizzoli. “Combinado com inteligência synthetic (modelo codificador-decodificador), conseguimos pela primeira vez reconstruir a estrutura tridimensional de moléculas de proteínas individuais a partir de imagens bidimensionais de fluorescência, baseadas em microscopia de luz convencional.”
Uma comparação foi feita entre a microscopia ONE e a microscopia crio-EM de alta resolução. A estrutura proteica determinada do receptor GABAA, que controla a atividade das células nervosas do cérebro e da medula espinhal, mostrou como o novo método funcionou bem.
“UMA microscopia permite visualizar toda a estrutura do receptor GABAA. Isso consiste em 15 a 20 por cento de loops desordenados, cuja média deve ser calculada a partir de até cem mil dados de imagem usando crio-EM. Como estes loops são componentes flexíveis, ou seja, podem variar de receptor para receptor, estes dados de imagem não podem ser calculados adequadamente. Os loops não são, portanto, reconhecíveis. Com UMA microscopia, as primeiras imagens individuais de toda a molécula ficam disponíveis menos de 72 horas após o início da expansão”, diz o Dr. “Essa técnica permite atingir resoluções de mais de dez nanômetros mesmo com um microscópio óptico mais antigo. Para efeito de comparação, nosso materials genético, o DNA, tem um diâmetro de cerca de 2,5 nanômetros e pode ser visualizado usando esta técnica. Qualquer laboratório, independentemente de seus recursos financeiros, pode produzir imagens de altíssima resolução utilizando a técnica de microscopia ONE. Esta é uma revolução na microscopia com implicações de longo prazo para a ciência e a tecnologia.””
Vários potenciais de aplicação para diagnóstico
A microscopia ONE permite detectar alterações na forma de proteínas danificadas ou tóxicas em amostras humanas e, portanto, oferece uma ampla gama de aplicações potenciais. Para que as proteínas desempenhem sua função correta dentro da célula, elas devem adotar uma estrutura tridimensional. Isto é conseguido dobrando a proteína, um processo no qual podem ocorrer erros. As proteínas mal dobradas são degradadas ou levam a depósitos tóxicos nas células. Além disso, ocorre uma deficiência da proteína correspondente e uma perda associada de função na célula e no organismo como um todo.
“UMA microscopia poderia permitir um diagnóstico visible de doenças de dobramento incorreto de proteínas, como a doença de Parkinson, com base em amostras de sangue”, diz o professor Rizzoli.
Usando UMA microscopia, já foi possível visualizar e classificar os agregados da proteína alfa-sinucleína em amostras de líquido cefalorraquidiano de pacientes com Parkinson. Um enrolamento incorreto da alfa-sinucleína leva à formação desses agregados, que são depositados no cérebro e são responsáveis pela morte das células nervosas.
“Como podemos reconhecer facilmente o formato desses agregados, existe a possibilidade de um diagnóstico precoce dessa doença neurodegenerativa”, afirma o professor Rizzoli. “Isso daria aos pacientes acesso a um tratamento precoce, eficaz e personalizado antes que o cérebro fosse gravemente danificado.”