Os pesquisadores do SLAC desenvolvem uma abordagem para orientar melhor a preparação de fatias de células para imagens criogênicas de tomografia eletrônica.
É complicado tirar imagens de pequenas estruturas dentro das células. Uma técnica, a tomografia crioeletrônica (crio-ET), dispara elétrons através de uma amostra congelada. As imagens formadas pelos elétrons que emergem permitem aos pesquisadores reconstruir a arquitetura interna de uma célula em 3D com resolução quase atômica.
O problema é que esse método não funciona se a amostra for muito espessa. Os elétrons não conseguem penetrar na maioria das células, incluindo as células humanas. Em vez disso, os investigadores utilizam um feixe de iões para moer estas células mais robustas até fatias de 200 nanómetros de espessura, mas então surge outro desafio: garantir que a estrutura de interesse – um ribossoma ou um cloroplasto, por exemplo – está realmente contida nesta fatia fina. Muitas vezes são necessárias várias tentativas para capturar o objeto alvo em uma amostra erodida.
Agora, ao combinar a microscopia óptica com a moagem por feixe de íons, os cientistas do Laboratório Nacional de Aceleradores SLAC do Departamento de Energia identificaram um sinal adicional na luz fluorescente que pode guiar o processo de moagem. Esta técnica melhora a precisão da moagem guiada opticamente em aproximadamente uma ordem de grandeza, o que permitirá que a crio-ET atinja mais facilmente estruturas pequenas e raras dentro das células, incluindo vírus invasores.
“Nossa abordagem informa onde seu objeto está dentro da seção last de célula fina com muita precisão e alta taxa de sucesso“, disse Peter Dahlberg, professor assistente do SLAC e da Universidade de Stanford.”Essa melhoria também melhora muito a eficiência, pois você gasta menos tempo fresando e errando seus objetivos.” Dahlberg desenvolveu esta técnica que economiza tempo, que foi publicada em Comunicações da Naturezacom seus associados de pesquisa Anthony Sica e Magda Zaoralová.
A equipe usou o chamado sistema tri-coincidente, que alinha os planos focais de três instrumentos diferentes: um microscópio eletrônico de varredura, um feixe de íons para moagem de células e um microscópio óptico para observar pequenos objetos marcados com produtos químicos fluorescentes. Ao contrário dos sistemas comerciais, que não possuem instrumentos co-alinhados, este sistema permite aos pesquisadores monitorar a fluorescência durante a moagem.
Embora os sistemas tri-coincidentes normalmente não consigam resolver objetos menores que 200 nanômetros devido às limitações ópticas fundamentais desses instrumentos, Dahlberg e sua equipe recorreram à interferência, um fenômeno de interações de ondas de luz, para superar essa limitação.
À medida que um feixe de íons corrói a parte superior de uma célula, a luz fluorescente do objeto de interesse brilha por baixo. A superfície superior da amostra reflecte estas ondas de luz, que depois giram para interferir com a luz que chega – tal como as ondulações num lago que se cruzam e criam padrões mais complexos. Neste caso, à medida que a superfície da amostra é erodida, a interferência faz com que a luz fluorescente dos objetos marcados diminua e aumente de brilho. Sica escreveu um software program que pode localizar com precisão o objeto fluorescente com base nesses padrões de escurecimento e brilho, permitindo uma fresagem mais precisa.
Para testar a abordagem, a equipe imaginou um vírus de 26 nanômetros de largura infectando uma célula humana, demonstrando que esta abordagem pode atingir estruturas biológicas anteriormente fora dos limites da crio-ET. A técnica poderia ser aplicada a outras partículas virais e estruturas minúsculas e transitórias envolvidas na divisão celular, bem como a outros objetos.
“Quero mostrar ao campo que usar esse efeito e essa geometria tri-coincidente é o caminho certo para atingir algo muito pequeno em células em seu estado nativo,“Dahlberg disse.
Em seguida, a equipe deseja incorporar métodos avançados de microscopia de luz no sistema tri-coincidente para melhorar ainda mais a qualidade da imagem óptica e obter as imagens crio-ET mais informativas possíveis.
“Há muita pesquisa e desenvolvimento na moagem, mas quero incorporar técnicas de fluorescência mais sofisticadas e sofisticadas“, disse Sica.
A pesquisa foi financiada em parte pelo DOE Workplace of Science, pelos Nationwide Institutes of Well being e pela Chan Zuckerberg Initiative DAF, um fundo assessorado pela Silicon Valley Neighborhood Basis.