O método de microscopia quebra barreiras em imagens químicas em nanoescala

Os microscópios de super-resolução de hoje tornaram possível observar o mundo em nanoescala com detalhes sem precedentes. No entanto, eles exigem etiquetas fluorescentes, que revelam detalhes estruturais, mas fornecem poucas informações químicas sobre as amostras que estão sendo estudadas.

Essa desvantagem levou o desenvolvimento de técnicas de imagem vibracional, que podem identificar moléculas com base em suas ligações químicas exclusivas sem alterar a amostra. Esses métodos detectam alterações físicas nas amostras quando absorvem a luz do infravermelho médio (MIR), como mudanças no índice de refração causadas pela absorção de calor ou sinais acústicos induzidos pela temperatura. E, no entanto, os métodos existentes geralmente lutam com os níveis fracos de sinal, dificultando a obtenção de alta resolução (como os detalhes podem ser vistos) e um forte contraste químico (como as moléculas podem ser distinguidas).

Como relatado em Fotônica avançadauma técnica recém -desenvolvida, a iluminação estruturada Midfra -Frafrary Microscopy (SIMIP), agora aborda essa limitação com uma resolução duas vezes melhor que a microscopia convencional.

Desenvolvido por pesquisadores da Universidade de Zhejiang, China, liderados pelo Prof. DeLong Zhang, a nova técnica representa um avanço significativo na imagem vibracional, abrindo novas possibilidades para análise química e biológica em nanoescala.

Zhang observa: “A microscopia Simip integra os princípios da microscopia de iluminação estruturada com detecção fototérmica infravermelha médio. A fotodetecção de infravermelho médio fornece especificidade química, enquanto a microscopia de iluminação estruturada aumenta a resolução espacial da amostra”.

O sistema consiste em um laser quântico em cascata (QCl) que excita ligações moleculares específicas, causando aquecimento localizado que reduz o brilho de moléculas fluorescentes adjacentes. Simultaneamente, um sistema SIM que consiste em um laser de onda contínua de 488 nm e um Modulador de luz espacial (SLM) gera padrões de luz listrados que são projetados na amostra em diferentes ângulos.

Esses padrões criam franjas Moiré, codificando detalhes de alta frequência anteriormente não resolvíveis em sinais detectáveis ​​de baixa frequência que são capturados por uma câmera CMOS (SCMOS) científica. Ao comparar imagens tiradas com e sem absorção vibracional, o Simip reconstrói imagens de alta resolução que são ricas em informações químicas e espaciais.

A equipe aplicou os algoritmos de desconvolução Hessian e esparsa para alcançar um maior Resolução espacialaté ~ 60 nm, com uma velocidade de imagem acima de 24 quadros por segundo, superando imagens fototérmicas convencionais de MIR.

Para validar a precisão do SIMIP, os pesquisadores o testaram em esferas de polimetil metacrilato de 200 nm incorporadas com corantes fluorescentes termossensíveis. Varrendo o QCL entre 1.420-1.778 cm^-1 Vary, o SIMIP reconstruiu com sucesso os espectros vibracionais, os resultados correspondentes da espectroscopia de infravermelho de transformação de Fourier (FTIR).

Em termos de resolução, o SIMIP alcançou uma melhoria de 1,5 vezes em relação à imagem fototérmica convencional de MIR, com uma largura complete no meio-máximo (FWHM) de 335 nm versus 444 nm em métodos padrão. Além disso, foi capaz de distinguir entre esferas de poliestireno e polimetil metacrilato nos agregados de sub-diferença, o que period impossível com a microscopia padrão de fluorescência.

Uma vantagem adicional do SIMIP é sua capacidade de detectar a autofluorescência – a fluorescência pure emitida por certas moléculas biológicas. Isso pode ser alcançado com o SIM de Widefield para SIM de varredura de pontos para excitação estruturada de autofluorescência ou usando um feixe de sonda de comprimento de onda mais curto para um método de detecção fototérmica de campo largo para aumentar a compatibilidade com as configurações ópticas existentes.

Ao integrar o SIM ao MIP, o Simip alcança imagens químicas de super-resolução de alta velocidade além do limite de difração. Este método abre novas possibilidades para observações em ciência de materiais, pesquisa biomédica e análise química. Por exemplo, os pesquisadores imaginam usando o Simip para detectar metabólitos de moléculas pequenas e analisar suas interações com estruturas celulares.

A equipe agora planeja aprimorar a sincronização temporal de Simip para melhorar ainda mais a velocidade e a precisão da imagem, além de explorar corantes sensíveis à temperatura para aumentar a sensibilidade. Com modificações mínimas de {hardware} nos sistemas SIM existentes, o Simip está pronto para adoção em laboratórios em todo o mundo.